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 流式細胞儀分析(Flow cytometry)

服務簡述：以流式細胞儀分析檢體細胞的生理生化特性，或以專一性抗體偵測細胞表面抗原，並進行分群計數、百分比分析。

服務種類

(1) 細胞週期分析：以PI進行染色，檢測藥物對癌細胞是否造成cell cycle arrest。

(2) 細胞凋亡分析：以Annexin-V/PI進行染色，檢測藥物誘導細胞凋亡的情形，可區分早期凋亡以及晚期凋亡。

(3) 特定CD marker之分析：如基礎之NKTB分析、Treg分析等，同時協助抗體與CD marker配色、選用。

(4)上機前處理，包含動物犧牲、組織處理、全血之裂解。

交件時間：

約1～2週。

收樣標準

(1)細胞足量，建議上機時的細胞濃度為5x10⁵～1x10⁶ /ml。

(2)FSC/SSC之圖形應可看出主要細胞群Main。

(3)實驗必須有control組。

檢體種類：

(1)全血。

(2)肺泡沖提液。

(3)細胞。

(4)組織。

(5)其他特殊檢體。

服務流程：

(1)專人討論實驗流程，確認檢測項目、檢體類型、收件方式、前測試以及報價。

(2)先支付材料費或整體案件50%之訂金。

(3)執行上機前之品管。

(4)執行實驗。

(5)出具報告(Raw data為FCS檔、以PDF整理好之結果圖、Excel整理好之統計表)。

(6)支付尾款、結案。

常見QA：

細胞週期部分：可參考之前流式細胞儀cell cycle的介紹文章

1.圖形出現高背景？

Ans：主要原因為RNAse失效。補救辦法：重新添加RNAse，延長其反應時間。

2.未出現典型圖形？

Ans：

(1)檢查圈門位置是否正確。

(2)調整Gain值(電壓)，確認螢光訊號落在可偵測範圍內。

(3)確認螢光的參數為linear，而非log。

(4)確認G1與G2/M位置其螢光強度是否接近2倍。

3.出現典型圖形，但各組別G1、G2/M位置有偏移？

Ans：通常是組別間細胞數量不同，分配到染劑的量有落差。

補救方法：

(1)細胞固定之前先進行細胞計數。

(2)若實驗中出現該問題，將訊號較弱的組別重新添加染劑進行反應。

(3)捨棄套用軟體的分析方式，手動定義Histogram的位置。

4.圖形鋸齒狀嚴重？

Ans：減少清洗的步驟。

5.Control組細胞出現cell cycle arrest？

Ans：細胞培養時的問題，培養密度過高、汙染都有可能造成cell cycle arrest。

細胞凋亡部分：可參考本篇文章

1.對照組死亡嚴重？

Ans：細胞培養或處理時造成壓力，應嘗試縮短處理時間。

2.細胞都無死亡的情形？

Ans：須排除實驗條件問題或是染色條件之問題。

(1)務必設計一組確定會讓細胞死亡的positive control，如以H2O2、漂白水處理之細胞，若該組別也無訊號則為染色問題；若該組別有訊號則應調整操作條件。

3.細胞主群因藥物處理而偏移？

Ans：正常現象，凋亡的細胞在FSC/SSC上的位置會往左上角移動，在分析時，圈選主群細胞的位置應將範圍延伸至左上角。

4.訊號位置異常？

Ans：

(1)針對Annexin-V、PI都做單染，進行螢光補償，單染部分應注意，不可用健康的細胞來做單染(會很少訊號過去，造成補償錯誤)

(2)若擔心是染劑因素所造成，可改用7-AAD取代PI，使染劑發散波段互相干擾的情形減少。

免疫細胞染色部分：

1.如何確認訊號有真實表現而非偽陽性？

Ans：多做一組isotype control，與實驗組疊合，判定真實訊號位置。

2.若要同時看多種細胞，但流式細胞儀配備的螢光或濾片不夠多？

Ans：分組染色，一樣本分成2管。A染：CD3、CD4、CD8；B染：CD45、CD3、CD19依此類推。

3.流式細胞儀如何做絕對之細胞計數？

Ans：配合已知數量的beads，進行實驗，以實際收取到的顆數與理論數量進行校正。