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講到如何挑選流式細胞儀抗體以及染劑，首先需要知道有兩大重點，第一是研究者想要看甚麼？以及單位中硬體設備的限制。

今天若目標明確，要看外周血當中NK細胞的數量與比例，便會需要對代表NK細胞的marker進行染色，如CD16、CD56以及CD3；若想看T細胞與B細胞的分型，便需染CD45、CD3、CD19、CD4、CD8這幾個surface marker；若想區分細胞的死活，則會選擇一系列相關的核酸染劑(如PI、DAPI、7-AAD等)

以硬體設備來說，我們經常聽到流式細胞儀的規格，可能是一雷四色、二雷六色甚至是三雷十五色，這些雷射代表儀器所配備的激發光源，而這些顏色則代表儀器所配置的通道或是濾片，這些幾雷幾色，在先天上就決定了我們的實驗該如何設計、以及會遇到如何的限制。

在先前的文章中，有提到流式細胞儀的光學概念，每種螢光物質，他吸收的波段、激發出來的波段皆不同，儀器配備哪支雷射，自然只能挑選能被該雷射激發的螢光物質，以最常見的488 nm藍光雷射為例，我們能夠選擇會被488 nm激發的染劑，如FITC、PE等，相反我們不會去選擇APC作為染劑(因為最大激發波段不對)，或是也不會選擇應由405 nm雷射激發的pacific blue染劑。

所以第一步驟，確定雷射，以及有配備濾片的通道，接著便能開始確認，有哪幾種螢光物質是可以選擇的，可參考Fig.1筆者彙整的常用染劑，以及相對應激發、發散之波長。

Fig.1 . 常用雷射、螢光物質光學特性、濾片整理。

選定能使用的螢光物質之後，接著便是要找抗體，若你的流式細胞儀所能夠選用的螢光夠多，我們大可將所有的CD marker列出，接著一個蘿蔔一個坑，一一為他們選定最合適的螢光物質，在這邊比較需要注意的一個點是，在眾多螢光物質當中，有些顏色是古老的基本款，最陽春的機型都能偵測的顏色，如FITC、PE等，這些顏色可以留給CD marker中較特殊、較少人研究的 (也許就是研究者的目標)，因為抗體較容易找尋，訊號也強；反之，讓常見的CD marker去配對較少見的顏色，或是較弱的螢光，通常能夠使實驗的組別更完整。

至於螢光的強弱，可參考以下的圖表(Fig. 2)、(Fig. 3)：

Fig. 2. 整理自(Maecker & Trotter, 2008)的文獻，該文章使用BD™ LSR II以及BD FACSCanto™測試不同螢光染劑的stain index。(強弱由上至下排列)

Fig. 3. 整理自Thremo 的網站。該文章使用BD™ LSR II測試不同螢光染劑的stain index。(強弱由上至下排列)。

而Fig.2、Fig.3 中，stain index是怎麼計算出來的呢？可參見Fig.4。

Fig. 4. 說明染劑的stain index是如何計算得來的(Maecker & Trotter, 2008)。其中D代表陽性訊號與陰性訊號的差距；W則代表陰性訊號的分布。D/W則為stain index。一般若我們染色時不進行wash，陰性群的細胞會向右靠近陽性群，使stain index縮小。

以下舉幾個配色實例：

(1)假設儀器配備488 nm雷色，有四個通道，欲分析樣本中Treg的比例，可以如何選色？

a. 確認Treg的CD marker ：通常會染CD3、CD4、CD25、Foxp3。

b. CD3、CD4在細胞中表現較多；CD25次多Foxp3較少。

c. 選擇488 nm下，搭配濾片可使用的染劑：FITC、PE、PerCP、PE-Cy7

d. Foxp3搭配PE (少配強)、CD25配(FITC)、CD4配PerCP、CD3配PE-Cy7

(2)假設儀器配備488 nm、640 nm雷色，有五個通道，欲分析Th1/Th2/Th17的比例，可以如何搭配？

a. 確認CD marker：Th1：CD45、CD3、CD4、INF-r；Th2：CD45、CD3、CD4、IL-2；Th2：CD45、CD3、CD4、IL-17

b. CD45、CD3、CD4在細胞中表現較多；IFN-r、IL-2、IL-17表現較少。

c. 選擇488 nm、640 nm下，搭配濾片可使用的染劑：FITC、PE、PerCP、PE-Cy7、APC、APC-Cy7。

d. INF-r、IL-2、IL-17先進行配色，可配PE、APC、AF488；CD45、CD3、CD4則配PerCP、PE-Cy7、APC-Cy7。

討論完目標蛋白的多寡與染劑強弱的搭配，若硬體設備的通道足夠多，且欲分析的CD marker較少，此時也可以考慮螢光間互相干擾的問題，像是PE、FITC他們的發射波段較寬，有時候會漏到彼此的通道中，這時就需要額外做螢光補償，將溢出的訊號以數學方式扣除(現在大多機器可以做自動補償)，這時就可以選擇分散得較開的染劑，減少互相干擾的問題。

說完抗體與染劑的部分，我們接著討論到，若我想同時看的CD marker數量很多，但我硬體設備就是有限制時，該怎麼辦？

這時可以考慮，將一管樣本，分成多管，假設想看的目標很多，有12個marker，但機型只有一雷四色，這時便可將樣本分成三組，每組做4顏色的染色，可克服此問題，唯二的缺點為，所需要上機的數量會增加，且樣本若很少時，則會浪費，這需要實驗者進行斟酌。

參考文獻：

Maecker, H., & Trotter, J. (2008). Selecting reagents for multicolor flow cytometry with BD™ LSR II and BD FACSCanto™ systems. Nature Methods, 5(12), an6-an7.       

https://www.thermofisher.com/tw/zt/home/references/newsletters-and-journals/bioprobes-journal-of-cell-biology-applications/bioprobes-71/bioprobes-71-flow-cytometry-panel-design.html