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質體構築 Cloning

服務簡述：利用PCR、限制酵素等分子生物學工具，建構實驗所需的質體。

服務種類：

(1) TA-cloning：將特定的片段以PCR做出來後，選殖至帶有multiple cutting site (MCS)的質體中，為最單純的質體構築。

(2)表現載體構築：以pET系列載體為backbone，將欲表達之基因接入，以達成表現重組蛋白之目的。

(3)帶有reporter基因之質體構築：轉染實驗中，為確認質體有順利進到細胞，並表達目標蛋白，通常會在目標基因前或後接上reporter gene (如GFP、RFP、Luciferase等)。

(4) Promoter之質體構築：執行promoter assay實驗時，通常會構築deletion或mutation後的promoter配合luciferase來探討transcription factor與promoter的交互作用關係 ；另也可以構築具有組織專一性的promoter，使基因只在特定組織或器官表現。

(5)帶有開關的質體構築：利用inducible的promoter來控制基因在理想的時間點表現或不表現，如Tet-on / Tet-off system、溫度誘導promoter HSP70、HSP90之質體構築。

(6)特殊質體之構築：如需使用特殊comptent cell、帶有microRNA之質體構築、病毒質體構築(通常size巨大)等。

使用材料：

(1)由客戶端提供之template、backbone，需經過定序，確認序列正確。

(2)由優服公司提供現有之質體庫、或指定廠商之backbone進行。

交件時間：

視案件複雜程度而定，一般TA-clonning或較單純之質體構築交件時間約為2週，牽涉多步驟構築、特殊序列之質體(二級結構、重複序列)、分子量較大之質體8 kb以上之交件時間約為5～6週。

服務流程：

(1)專人討論實驗流程，確認質體構築之細節、收件方式、報價。

(2)先支付材料費或整體案件50%之訂金。

(3)確認材料序列之正確，以定序、切酵素等方式進行。

(4)執行構築實驗，並進行及時反饋。

(5)交付實驗結果包含定序之COA、5 ug的質體(Liquid,標示濃度、OD260/OD280 ratio)。

(6)付尾款、結案。

常見QA：

1.轉染實驗中目標蛋白未表現出來？

Ans：這需要分成多個步驟來檢查：

(1)首先確保每次執行實驗的plasmid DNA為新鮮現抽，雖然DNA較穩定，但環境中可能還是有nuclease會將DNA降解。

(2)若plamid DNA為現抽，最好實驗前可先送定序(多花1～2天的時間確認序列正確，沒有mutation、insertion或deletion)，在high copy的質體中，突變的機率較高(如pUC系列的質體)。

(3)轉染條件的檢查，執行轉染時，最好設計一個單純驅動GFP或RFP表現的control組，若顯微鏡下看不到螢光表現，應從轉染條件與轉染試劑的問題進行排除。

(4)若轉染條件無問題，需考慮目標蛋白跟reporter基因同時表現是否會影響構型，可試著將reporter基因變換位置，如從後調到前，或是在兩個蛋白連接處接上T2A元件，可使兩個蛋白質做出來後於T2A處斷裂，或另外接上IRES元件，使一條mRNA複本中，兩個蛋白質分開轉譯。

(5)若是蛋白質有表現，但表現位置出問題，如該上膜的未上膜，該進核的未進核，可添加幫助其上膜或進核的signal peptides。

2.以微生物為載體表現重組蛋白卻未見表現之原因？

Ans：

(1)確認使用的菌株是否正確，常用建構質體的菌株為DH5a，表現蛋白用的菌株為BL21，BL21內含有T7的polymerase，才可使下游的mRNA與蛋白質被製造出來(也記得要加入IPTG)。

(2)當細菌過量表現重組蛋白時會造成壓力，使其將過多的蛋白塞入inclusion body並錯誤摺疊，通常會將inclusion body純化後，將蛋白質renature。

(3)確保抗生素有效，若未以抗生素篩選帶有質體的細菌，經過幾代的複製後，質體可能會被菌株吐掉。

3.質體構築時酵素切不出來？

Ans：

(1)留意序列上的突變、primer在合成時不管哪一家都有可能合成錯誤(機率問題)。

(2)限制酵素在特定序列排列組合下產生甲基化的問題(Dam methylation)，如惡名昭彰的XbaI。