Extracellular vesicles (EVs)係指細胞外排，大小介於30 nm～1000 nm的顆粒，其中比較常被探討的組成為microvesicles以及exosome，他們的幾個主要差別包含，mcirocesicles的大小通常在150 nm～1000 nm之間；exosome的大小通常在30～150 nm之間，除此之外，外排的機制也有所不同，microvesicles通常是透過出芽的方式(bud)離開細胞，而exosome則會在細胞內部形成(multivescular bodys) MVB小體，再藉由MVB小體與細胞膜融合後將exosome排出。
Fig.1 .細胞中microRNA進入exosome以及exosome外排的機制(Zhang et al., 2015)。
Exosome 為大小介於30 nm～150 nm由細胞外排的小顆粒，存在於各式各樣的體液中，最早exosome被認為是用作將細胞內的廢棄物排出，然而近幾年來的研究卻發現，exosome當中所包含的mRNA、microRNA等物質，在跨細胞的交互作用(溝通)中扮演著重要的腳色，甚至在某些癌症發展轉移能力的過程中，癌細胞也會分泌大量的exosome作為先遣部隊，先替自己打造適合的轉移環境，相反的，科學家也可以利用exosome作為藥物的載體，協助對抗某些特定疾病，於是乎exosome的研究可說是如雨後春筍般大量的冒了出來，除此之外，exosome 也在免疫反應中扮演著重要角色，像(Buschow et al., 2009)等人的研究中就發現dendritic cell除了透過MCH II與T細胞表面抗原結合以傳遞訊息外，也會透過傳遞exosome來調節help T cell的活化與否。而(Janowska‐Wieczorek et al., 2005)的研究中也指出，從血小板中分離出來的exosome，能使人類肺癌細胞株A549的MMP-2、MMP-9表現量增加，使癌細胞組織侵犯的能力增強。
然而exosome的大小比我們熟悉的細胞要來得小很多，所使用的研究工具也和細胞大有不同，如exosome的分離、純化、種類的鑑定、如何定量，以及內含物的分析等等，大大考驗了當時的技術與科學家的腦袋。其中以流式細胞儀為例，許多2015、2016年以前推出的機型，大多只能觀測到最小300 nm左右大小的顆粒，再小下去就會因硬體的極限而難以分析，這時候若想要分析exosome，該怎麼辦呢？
分析如exosome這類型的Extracellular vesicles，常使用的技術分別為：
(1) NTA奈米粒子追蹤技術 (Nanoparticle Tracking Analysis)：透過粒子在液體中行布朗運動的特性，透過雷射以及感光元件紀錄粒子的運動軌跡、速度，進而計算出大小、數量與濃度。(可參考：https://ins.dksh.tw/stories_detail_13.htm)
Fig.2 .透過差異性離心，分別分離出不同大小的Extracellular vesicles (橘色、藍色)，並以NTA進行分析的結果(Ender et al., 2020)。
(2)電子顯微鏡技術：透過電子顯微鏡直接拍攝、觀察Extracellular vesicles的大小與數量。
Fig.3 .Extracellular vesicles在SEM電子顯微鏡下的影像，比例尺為100 nm (Ender et al., 2020)。
(3)免疫學方法分析，如ELISA、Flow cytometry
這就要說到Exosome表面所攜帶的CD marker了，之前有提到，CD marker時常作為鑑定特定細胞群的指標，如NK、T、B等等，而常用作於鑑定exosome的指標為CD9、CD63以及CD81。於是乎，exosome的ELISA kit被開發出來，透過三明治般的方法，將CD9的抗體coating在孔盤表面，當檢體中的exosome與CD9反應後，接著再以另一隻一抗抓取CD9，並以Streptavidin-HRP的二抗放大訊號，讓研究者得以量化檢體中exosome的數量。
同樣在流式細胞儀當中，也有廠商開發出帶有CD9抗體且能發螢光的磁珠，磁珠的大小在4 um～9 um之間，將磁珠與檢體反應後，再進行CD63或CD81的染色，在流式細胞儀上便能透過選取磁珠的顆粒，進而分析exosome訊號的強弱了。
Fig.4 .能夠抓取Extracellular vesicles的珠子設計。(A)大小為6 um的珠子，最多每顆可抓取6420顆Extracellular vesicles。(B)珠子上coating CD63的capture antibody，並以CD9或CD81的detection anibody進行Extracellular vesicles的抓取。
在其他非專一的染色上，Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)、PKH26、PKH76、CMDil染劑也經常用作這些Extracellular vesicles的染色。且近幾年推出的新型流式細胞儀，甚至可以直接觀察到最小約80 nm大小的exosome，只是通常到此等級的流式細胞儀，通常會改以紫光雷射來做為激發光源，也以VSSC的感測通道來取代傳統FSC/SSC，除此之外，用已知大小、已知數量的珠子加入實驗，除了能協助定位以外，也能夠輔助定量。
Fig.5 .Beckmon Coulter的CytoFLEX Sizing Beads，beads由不同大小的乳膠顆粒或矽膠顆粒組成(Brittain & Gulnik, 2018)。
Reference
Brittain, G., & Gulnik, S. (2018). A nano-and microparticle mix for CytoFLEX size standardization. Journal of Extracellular Vesicles, 7, 272-272.
Buschow, S. I., Anderton, S. M., Stoorvogel, W., & Wauben, M. H. (2009). Activated T cells recruit exosomes secreted by dendritic cells via LFA-1. Blood, 113(9), 1977-1981.
Ender, F., Zamzow, P., von Bubnoff, N., & Gieseler, F. (2020). Detection and Quantification of Extracellular Vesicles via FACS: Membrane Labeling Matters! International journal of molecular sciences, 21(1), 291.
Janowska‐Wieczorek, A., Wysoczynski, M., Kijowski, J., Marquez‐Curtis, L., Machalinski, B., Ratajczak, J., & Ratajczak, M. Z. (2005). Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International journal of cancer, 113(5), 752-760.
Zhang, J., Li, S., Li, L., Li, M., Guo, C., Yao, J., & Mi, S. (2015). Exosome and exosomal microRNA: trafficking, sorting, and function. Genomics, proteomics & bioinformatics, 13(1), 17-24.
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