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在了解流式細胞儀的光學概念之前，我們要先談談光，光是一種以電磁波的能量，從我們肉眼可見的可見光外，包含紫外光、r射線、紅外光、微波等，都屬於電磁波。電磁波含有三個參數：波速、波長、頻率，波速=波長X頻率，電磁波波速=光速，且於真空中速度固定的情況下，波長與頻率就會成反比，波長越長者，頻率越低；波長越短者，頻率越高。

Fig.1 電磁波波譜的性質與對應。https://zh.wikipedia.org/w/index.php?title=%E9%9B%BB%E7%A3%81%E6%B3%A2%E8%AD%9C&oldid=62476446

在這邊我們著眼於可見光的部分，可見光由紅、橙、黃、綠、藍、靛、紫組成，其中紅光之外，肉眼不可見為紅外光，紫光之外，肉眼不可見為紫外光，照順序排下來的情況為：紫外光能量最強，波長最短，紅外光能量最弱，波長也最長。

了解電磁波與光的基礎特性後，接著我們討論甚麼是螢光？

Fig.2 . 雅布隆斯基圖 (Jablonski diagram)。

在(Fig.2)中，螢光物質其外層電子原先處於基態(Ground State)，後因吸收了外來的能量(通常為雷射光源)，其外層電子吸收能量後便會躍遷到更上層的軌域，成為激發態，激發態電子相當不穩定，會在極短的時間內(約10^-8～10^-10秒)再回到基態，過程中再將吸收的能量以光能的形式釋放出來，釋放出來的光則稱為螢光。而釋放出來的螢光能量，會比吸收的光源能量要來得低(因為有轉換成熱能的耗損)

有了這些基本知識後，在面對流式細胞儀的儀器以及實驗設計時，應該就不會如此陌生，將光學的知識帶到流式細胞儀當中，可以進一步知道：

1. 流式細胞儀中的雷射光源為何種顏色、波長為何？如波長340～380 nm為紫外光雷射、405～450 nm為紫光雷射、470～490 nm為藍光雷射、560 nm左右為黃光雷射、640～650 nm為紅光雷射等

2. 以雷射作為激發光(excitation)，螢光物質散色出來的發散光(emission)比較，發散光的能量會比激發光低，如FITC這個螢光物質，是由藍光488 nm雷射激發，發散出的波長為535 nm綠光，而不會跑出比488 nm短波長的光。

3. 了解每種螢光物質的特性，其激發光譜與發散光譜都會有所不同

Fig.3 . 螢光物質FITC的fluorescent spectrum。

以(Fig.3)為例，這是透過Thermo開發的Fluorescent spectraViewer所繪製，螢光物質FITC的吸收光譜(excitation)以及發散光譜(emission)，激發光譜由虛線表示，發散光譜以實線表示，我們可以發現，不論是吸收光譜或是發散光譜，通常為一個範圍，而在這個範圍中，有其最大激發光的波長(max ex)，以及最大發散光的波長(max em)。

Fig.4 . 螢光物質PE的fluorescent spectrum。

進一步說明，從PE的spectrum可知，在其激發光譜的部分於490 nm時有一個峰值，560 nm時有另外一個峰值(為最大峰值)，說明PE在這些波長的光源下，也會被激發出螢光；反之，PE的發散波長，除了575 nm時有最多的發散訊號外，在後面的波段(直至650 nm時)也都有較弱的發散訊號，這回答了流式細胞儀當中常見的幾個問題：

(1) 同個顏色，每家雷射的激發光源可能會略有不同，如藍光雷射，有的是488 nm激發光源，有的是473 nm，以FITC為例，這兩個波長同樣都落在FITC的激發光譜中，容許了一定程度的誤差(每家的濾片也會因規格不同有些微誤差)。

(2) 流式細胞儀機構內部為何有很多種長通、短通的濾片，或是濾片上只設計20 nm～40 nm的光波通過(帶通)?目的就是為了過濾掉發散光譜中多餘的這些光，以只收取最大發散光譜的光為目標。

(3) 執行多色染色實驗時，經常會聽到螢光補償(compensasion)這個名詞，這帶大家看一張圖來做說明。

Fig.5 . 螢光物質FITC與PE的emission spectrum以及濾片(535/30 nm,575/28 nm)。

從(Fig.5)我們可以觀察到FITC跟PE這兩者的發散光譜是重疊的，意味著當我執行雙染的實驗，同時染標記FITC與PE的抗體，若用535/30 nm的濾片收FITC的訊號時，同樣會收到來自PE的發散訊號；用575/28 nm的濾片收PE的訊號時，同樣會收到來自FITC的發散訊號，這些漏過去的光，可透過數學的計算去扣除，這過程即稱為螢光補償。

Fig.6 . 執行FITC的染色，左圖為未compensation，漏到PE channel的圖形；右圖為compensation後，將漏至PE的訊號扣除，修正後的圖形。

https://www.uth.edu/imm/service-centers/flow-cytometry/compensation-controls

至於實務上如何進行compensation，之後介紹多色實驗的流程中將詳細敘述。

補充：吸收光、螢光、冷光、磷光的差別?

前面有提到，螢光是有外來的激發光源下，螢光物質因電子躍遷而釋放出的光，當激發光源移除後，螢光自然就會消失，我們前面有提到此過程的時間非常短，大約在10^-8～10^-10秒內即可完成，但有些物質他釋放能量的時間會比較長，導致激發光源移除後，仍持續有發光現象，我們將之稱為磷光。

螢光與磷光是需要有激發光源，屬於光致發光，然而冷光則是透過化學反應，由化學能轉換為光能所釋放，不需要有激發光源，如螢火蟲就是透過化學的方式發出冷光。

而吸收光則是描述某些化合物，會吸收特定波長的光譜，利用這一特性，我們可以照射樣本一特定光源，並計算穿透樣本後的光子量，反推樣本中該化合物的含量為多少。

在實驗上，這些光的差別會影響到實驗儀器以及套組的選擇，之後在介紹光學儀器的章節時將進行詳細的說明。

Reference

https://www.uth.edu/imm/service-centers/flow-cytometry/compensation-controls

電磁波譜. (2020, October 21). Retrieved from 维基百科, 自由的百科全书: https://zh.wikipedia.org/w/index.php?title=%E9%9B%BB%E7%A3%81%E6%B3%A2%E8%AD%9C&oldid=62476446

Wikipedia contributors. (2020, May 25). Jablonski diagram. In Wikipedia, The Free Encyclopedia. Retrieved 10:54, May 20, 2021, from https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Jablonski_diagram&oldid=958801503