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介紹完流式細胞儀中常用的幾種圖形後，接著介紹圖形的圈選策略(gating strategy) 通常我們在看paper的時候，流式細胞儀只呈現最後一張圖，也就是最終Data的結果，但，最後一張圖的結果是怎麼得出來的呢?

為回答這個問題，筆者帶著大家逐一介紹：

1. 圈門(Gate)，在流式細胞儀吸取完我們的檢體後，除了樣本中的細胞會被呈現，細胞的碎片、雜質，甚至是粘連的團塊都會被儀器所記錄到，為了使我們的數據更乾淨、準確，我們會設置圈門，圈出非碎片、非團塊的主要細胞群 (Main)

Fig.1 .透過圈門圈選主要細胞群，排除非目標細胞以及碎片(Kulkarni et al., 2014)。

我們可以從(Fig.1)中看到，在機器收到的所有訊號當中，作為我們主要分析標的的那群細胞，只占全部的33.8%，其餘皆為碎片或其他細胞。這邊比較需要注意的是，我們全身都有免疫細胞，但是不同器官、檢體不同的處理方式，皆會影響到FSC、SSC的圖形變化(如spleen、whole blood、PBMC、BALF等)。

至於一張圖上是否能設多個圈門?答案是可以的，你可以給每個圈門有不同的名稱，筆者的習慣是先設大圈門以圈到好幾群細胞(但把碎片排除)，再針對每個細胞群去分別設置獨自的圈門，以進行後續的分析。

2. Gating strategy

接續前面，當設置好圈門後，所產生的下一張圖(可為histogram或dot plot)，原則上會接續第一張圖的圈門邏輯，再往下圈選時，即可產生邏輯的連貫性，透過陰性、陽性的差異，可分類出多種細胞。

Fig.2 .NK細胞的Gating Strategy。(Kulkarni et al., 2014)

以(Fig.2)的圖為例，我們可以看到作者對病人樣本進行4色染色(CD3-PerCP、CD56-APC、CD16-FITC、NKG2D-PE)，其Gating strategy為：

1. 透過FSC/SSC的做圖，圈選出病人PBMC中的主要細胞群Lymphocyte。

2. 接續Lymphocyte的圈門，以CD3區分出陽性、陰性的細胞群，作者圈選CD3陰性的細胞群進行後續分析(T細胞為CD3陽性，NK細胞為CD3陰性)

3. CD3陰性的族群中，首先描述CD56陽性、CD16陰性的細胞群(CD3^-CD16^-CD56⁺)，為Regulatory NK cell subset

4. CD3陰性的族群中，CD56陽性、CD16陽性的細胞群(CD3^-CD16⁺CD56⁺)，為Cytotoxic NK cell subset

5. CD3陰性的族群中，CD56陰性、CD16陰性的細胞群，為非NK細胞。

6. CD3陰性的族群中，CD56陰性、CD16陽性的細胞群(CD3^-CD16⁺CD56^-)，為Defective NK cell subset。

7.從3.這群Cytotoxic NK cell subset再區分出表現活化指標NKG2D的數量，表示該樣本(體內高HIV病毒的組別)有表達NKG2D的Cytotoxic NK cell占全部Cytotoxic NK cell有28.6%。

8.也是從3.這群Cytotoxic NK cell subset再區分出表現活化指標NKG2D的數量，表示該樣本(受HIV感染，但長期無嚴重發病的病人組別)有表達NKG2D的Cytotoxic NK cell占全部Cytotoxic NK cell有96.3%。

9.為表達NKG2D-PE的細胞Histogram，此圖說明螢光強度10²以上的訊號為陽性之訊號，可以Histogram之陽性位置回去對應(Fig.2D、Fig.2E)的位置。

3.Gating strategy (2)

Fig.3 .圈選人體PBMC中T細胞與Monocyte的分類(Li et al., 2014)。

以(Fig.3)的圖為例，我們可以看到作者的Gating strategy為：

1.從FSC/SSC的圖形中先分出lymphocyte。

2.從FSC/SSC的圖形中先分出Monocyte。

3.lymphocyte中分出CD8陽性的cytotoxic T cell。

4.lymphocyte中分出CD4陽性的helper T cell。

5.CD8陽性的cytotoxic T cell再透過CD45RO分離出Memory cytotoxic T cell。

6.CD8陽性的cytotoxic T cell再透過CD45RA分離出Naive cytotoxic T cell。

7.CD4陽性的helper T cell再透過Foxp3、CD25分離出Regular T cell。

8.CD4陽性的helper T cell再透過CD45RO分離出Memory helper T cell。

9.CD4陽性的helper T cell再透過CD45RA分離出Naive helper T cell。

10.從Monocyte的族群中透過CD19、HLA-DR分離出(CD19^-HLA-DR⁺)的單核球。

11.從CD19^-HLA-DR⁺ Monocyte族群中透過CD16、CD14區分出CD14^loCD16⁺ 細胞群。

12.以及CD14⁺⁺CD16^-細胞群。

13. CD14^loCD16⁺ 細胞群可再透過CCR2、M-DC8分出兩群細胞，分別為CD14^loCD16⁺M-DC8⁺。

14.以及CD14^loCD16⁺M-DC8^-。

而因為每種樣本不同，細胞群可使用的標記不同(如Treg，有些文章以CD4+CD25+Foxp3+呈現(He et al., 2017)，甚至有的以CD4+CD25+CD127+來呈現(Narsale et al., 2018))，甚至是螢光物質選擇上的不同，都有可能會影響到最終圖的呈現，故若是第一次執行實驗，可參照已發表文章的gating strategy來執行。

4.細胞凋亡實驗的Gating strategy

Fig.4 .細胞凋亡實驗中AnnexinV/PI染色中，合適的Gating strategy。https://www.bio-rad-antibodies.com/apoptosis-flowcytometry.html

在Fig.4中，先從FSC與SSC的圖形來看，上圖為未處理藥物的組別，下圖為處理藥物的組別，一般以單一細胞株進行實驗(非血液或組織)，FSC/SSC中呈現的圖形會較為單純，不常出現多群細胞，通常只有主要細胞群以及碎片，但一旦經過誘導細胞凋亡的藥物處理後，細胞的形態會出現變化(細胞變小，顆粒性變多)，所以在FSC/SSC的做圖上，可以觀察到處理藥物凋亡的細胞形態會往左上角移動，所以如Fig.4中Gate A所圈選的範圍，為凋亡較晚期的細胞，Gate B所圈選的範圍，為未凋亡的細胞或者是凋亡早期的細胞，過去做apoptosis的經驗中，有許多人圈選的位置過窄，只集中在主要細胞群的位置，導致data的呈現不理想，這些細節之後在apoptosis的章節中會再談到。

Reference

https://www.bio-rad-antibodies.com/apoptosis-flowcytometry.html

He, Q., Li, G., Ji, X., Ma, L., Wang, X., Li, Y., & Fan, C. (2017). Impact of the immune cell population in peripheral blood on response and survival in patients receiving neoadjuvant chemotherapy for advanced gastric cancer. Tumor Biology, 39(5), 1010428317697571.     

Kulkarni, A. G., Paranjape, R. S., & Thakar, M. R. (2014). Higher expression of activating receptors on cytotoxic NK cells is associated with early control on HIV-1C multiplication. Frontiers in immunology, 5, 222.

Li, L., Lin, M., Krassilnikova, M., Ostrow, K., Bader, A., Radbill, B., Uribarri, J., Tokita, J., Leisman, S., & Lapsia, V. (2014). Effect of cholecalciferol supplementation on inflammation and cellular alloimmunity in hemodialysis patients: data from a randomized controlled pilot trial. PloS one, 9(10), e109998.

Narsale, A., Moya, R., & Davies, J. D. (2018). Human CD4+ CD25+ CD127hi cells and the Th1/Th2 phenotype. Clinical Immunology, 188, 103-112.