了解流式細胞儀的基礎原理以及可以執行的實驗項目後，接著跟大家分享該如何判讀流式細胞儀的圖形？
雖然市面上流式細胞儀的牌子琳瑯滿目，分析軟體也有百百種，但圖形的種類、如何判讀的邏輯卻不會差異太遠，以下根據常用幾種圖形進行介紹：
1.直方圖 (Histogram)
Fig.1 . 標記CD4-FITC之直方圖。
判讀直方圖時，可從標記的順序開始判讀，首先1.代表該圖所指之蛋白質名稱(可能為CD marker) 以及其所標記的螢光物質，Main與P2代表在該邏輯圈門下的情況
2.細胞的數量(Count)
3.螢光的強度(log顯示)，從2、3可知，Histogram通常是以細胞數量與螢光強度的作圖
4.代表該蛋白質在這群細胞中陽性以及陰性的比例，亦對應下方兩峰的分布情形，中線的部分則為陽性與陰性細胞群的界線。
2.散點圖 (Dot plot)
Fig.2 . 標記CD4-PE、CD8FITC之散點圖。(Das et al., 2014)
判讀散點圖時，可從標記的順序開始判讀，首先
1.標記CD4-PE的細胞其不同螢光強度(log)的分布
2.標記CD8-FITC的細胞其不同螢光強度(log)的分布
3. CD4-PE單陽性的細胞群其數量比例
4. CD4-PE、CD8-FITC雙陽性的細胞群其數量比例
5. CD4-PE、CD8-FITC雙陰性的細胞群其數量比例
6. CD8-FITC單陽性的的細胞群其數量比例。從圖中可知，這群細胞同時進行了CD4-PE、CD8-FITC雙色的染色，透過二維的散點圖，可分出(分別的單陽性細胞群、雙陽性細胞群以及雙陰性細胞群)。補充：圖中的範例為淋巴球中Helper-T (CD4+)、Cytotoxic-T (CD8+)的染色，這兩群T細胞通常為互斥，少有同時表現(CD4+CD8+)的T細胞
(延伸閱讀：同時表現CD4+CD8+ DP T細胞的功能以及研究)。
需要比較注意的是，圖形中十字象限的位置，十字象限的線分別對應了兩個不同螢光陽性與陰性的界線，此界線在跨樣本之間的位置應為固定，不可隨意調動。
3.密度圖 (Density plot)
Fig.3 . 標記CD4-APC、CD8α-PEAF610之密度圖(Bohner et al., 2019)。
密度圖跟散點圖最大的差別在於，雖然都是以一個細胞作為一點，但密度圖可呈現出細胞的密集程度，越往紅色代表細胞越多，越往藍色細胞越少，視覺上以利我們觀察。
4.等高線圖 (Contour plot)
Fig.4 . 不同處理的腫瘤細胞，其TAMs標記F4/80、CD11b之等高線圖(Monjazeb et al., 2016)。
等高線圖的優點是，當分析的細胞總體數量很少的時候，可透過等高線圖分辨出主要細胞群的位置；但相反，若今天細胞總體數量很多時，且主要細胞群為少數時，以等高線做圖，則容易使目標細胞群變得不明顯。除此之外，調整等高線圖中每條線幾顆細胞為一數(2顆為一數、5顆為一數、10顆為一數等)，也會影響到圖形的呈現。
5. FSC/SSC做圖
Fig.5 . 全血FSC與SSC的作圖。https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html
FSC為前向角散射光，訊號越強代表細胞顆粒越大，SSC為側向角散射光，訊號越強代表細胞顆粒複雜度越高，可以透過FSC、SSC的作圖選擇欲分析的細胞群。
6.以A跟H去黏連的作圖
Fig.6 . 以FSC-A與FSC-H去黏連的做圖。https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html
不論是在SSC或是FSC中，每一群細胞，其訊號的A (面積)跟H(高度)兩個參數應為固定之比值，若有出現在同樣高度下，面積卻較大的細胞群，通常為黏連之細胞群，可透過圈門將其排除，在有PI染色的情況下粘連的情形常容易發生。
Reference
https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html
Bohner, P., Chevalier, M. F., Cesson, V., Rodrigues-Dias, S.-C., Dartiguenave, F., Burruni, R., Tawadros, T., Valerio, M., Lucca, I., & Nardelli-Haefliger, D. (2019). Double positive CD4+ CD8+ T cells are enriched in urological cancers and favor T helper-2 polarization. Frontiers in immunology, 10, 622.
Das, I., Saha, K., Mukhopadhyay, D., Roy, S., Raychaudhuri, G., Chatterjee, M., & Mitra, P. K. (2014). Impact of iron deficiency anemia on cell-mediated and humoral immunity in children: A case control study. Journal of natural science, biology, and medicine, 5(1), 158.
Monjazeb, A. M., Kent, M. S., Grossenbacher, S. K., Mall, C., Zamora, A. E., Mirsoian, A., Chen, M., Kol, A., Shiao, S. L., & Reddy, A. (2016). Blocking indolamine-2, 3-dioxygenase rebound immune suppression boosts antitumor effects of radio-immunotherapy in murine models and spontaneous canine malignancies. Clinical cancer research, 22(17), 4328-4340.
