流式細胞儀基礎之介紹(一)
流式細胞儀是甚麼?
結合流體力學、光學、電學、細胞生物學的一門技術，在尋找治療腫瘤藥物的領域、免疫學研究領域，甚至是營養學研究的領域中為一不可或缺之研究工具。
請試著想像一群細胞在一個極細的管道中一個個排排站好、整齊劃一的通過，通過管道的同時，雷射打在細胞上，細胞因顆粒複雜度、大小、所帶的螢光(額外標記)，散色出來的光學特性(pattern)不同，這些光訊號會被感光元件收集，並轉換成電子訊號，藉由分析這些電訊號，能夠得知這一群細胞的組成、數量，以及特性。
舉例一：將全血以RBC lysis buffer處理後，透過收集前向角散色光(FSC)、側向角散色光(SSC)的資訊，能夠分辨出白血球(Leukocyte)中淋巴球(Lymphocyte)、單核球(Monocyte)、顆粒球(Granulocyte)的數量與組成。
Fig. 1. 全血經處理後，以FSC/SSC進行做圖，藉由大小與顆粒性區分出淋巴球(Lymphocyte)、單核球(Monocyte)、顆粒球(Granulocyte)等細胞群。
(https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.htmll)
舉例二：將全血以RBC lysis buffer處理後，並進行CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16/CD56的染色，將這些CD marker以不同顏色之螢光物質進行標記，可以細分出胞殺型T細胞(CD45+,CD3+,CD8+)、輔助型T細胞(CD45+,CD3+,CD4+)、B細胞(CD45+,CD19+)、NK細胞(CD45+,CD3-,CD16+,CD56+)
Fig. 2. 全血中NKTB的分布。(Boldt et al., 2014)
舉例三：將培養的細胞以Annexin V-FITC/PI進行染色，可以分辨出該群細胞中早期凋亡(early apoptosis)、晚期凋亡(late apoptosis)、細胞壞死(Necrosis)的族群。
Fig. 3. 乳癌細胞經不同濃度藥物處理後，以AnnexinV/PI的染色方式，判別早期凋亡以及晚期凋亡的分布。(Foo et al., 2019)
舉例四：將培養的細胞以酒精固定，並以RNAse處理、以PI進行染色，透過分析細胞內核酸的含量(定位2N以及4N)，可鑑定出該群細胞細胞週期的分布(G1、S、G2/M等)，也可透過分析Sub G1的比例判斷細胞是否有進行凋亡。
Fig.4 .細胞週期以及各期DNA含量之分布。(Gray & Coffino, 1979)
舉例五：將培養的細胞以DCFDA進行染色，可以分辨出細胞內產生活性氧物質ROS的強度，常用在尋找抗氧化天然物質、癌細胞凋亡的相關研究中。
Fig.5 .以DCFDA偵測細胞內ROS的原理以及預期之圖形。(Lyublinskaya et al., 2017)
舉例六：將培養的細胞以DiOC6進行染色，可以偵測細胞內粒線體膜電位的變化。
Fig.6 .以DiOC6偵測細胞膜電位的標準圖形，隨著處理癌細胞的藥物時間拉長，癌細胞的粒線體膜電位逐漸下降。(Lin et al., 2018)
舉例七：將培養的細胞以2-NBDG進行染色，可偵測細胞攝入葡萄糖的能力。
Fig.7 .癌細胞處理藥物後，其攝入葡萄糖的量隨時間下降。(Witney et al., 2009)
舉例八：將培養的細胞以Fura-2或Fluo-3、Fluo-4進行染色，以時間與螢光強度進行作圖，可以觀察一段時間內，細胞鈣離子流動的變化。
Fig.8 .刺激T細胞活化將影響T細胞內鈣離子的流出。(de Roquetaillade et al., 2019)
Reference
https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html
Boldt, A., Borte, S., Fricke, S., Kentouche, K., Emmrich, F., Borte, M., Kahlenberg, F., & Sack, U. (2014). Eight‐color immunophenotyping of T‐, B‐, and NK‐cell subpopulations for characterization of chronic immunodeficiencies. Cytometry Part B: Clinical Cytometry, 86(3), 191-206.
de Roquetaillade, C., Kandara, K., Gossez, M., Peronnet, E., Monard, C., Cour, M., Rimmelé, T., Argaud, L., Monneret, G., & Venet, F. (2019). Intracellular calcium signaling and phospho-antigen measurements reveal functional proximal TCR activation in lymphocytes from septic shock patients. Intensive care medicine experimental, 7(1), 1-4.
Foo, J. B., Ng, L. S., Lim, J. H., Tan, P. X., Lor, Y. Z., Loo, J. S. E., Low, M. L., Chan, L. C., Beh, C. Y., & Leong, S. W. (2019). Induction of cell cycle arrest and apoptosis by copper complex Cu (SBCM) 2 towards oestrogen-receptor positive MCF-7 breast cancer cells. RSC advances, 9(32), 18359-18370.
Gray, J., & Coffino, P. (1979). [19] Cell cycle analysis by flow cytometry. In Methods in enzymology (Vol. 58, pp. 233-248). Elsevier.
Lin, M. W., Yang, J. S., Lu, C. C., Lin, C., Kuo, S. C., Tsai, F. J., & Lee, M. R. (2018). 2-Phenyl-4-quinolone (YT-1) induces G2/M phase arrest and an intrinsic apoptotic mechanism in human leukemia cells. Oncology reports, 39(3), 1331-1337.
Lyublinskaya, O., Ivanova, J. S., Pugovkina, N., Kozhukharova, I., Kovaleva, Z., Shatrova, A., Aksenov, N., Zenin, V., Kaulin, Y. A., & Gamaley, I. (2017). Redox environment in stem and differentiated cells: A quantitative approach. Redox biology, 12, 758-769.
Witney, T. H., Kettunen, M. I., Day, S. E., Hu, D.-e., Neves, A. A., Gallagher, F. A., Fulton, S. M., & Brindle, K. M. (2009). A comparison between radiolabeled fluorodeoxyglucose uptake and hyperpolarized 13C-labeled pyruvate utilization as methods for detecting tumor response to treatment. Neoplasia, 11(6), 574-IN511.
