啟動細胞內的自毀按鈕
當體內的細胞累積突變造成生理機能失控時，體內會啟動一連串的訊息傳遞路徑，讓這些不正常的細胞自然的死亡，這個過程叫做細胞程序性死亡，或稱細胞凋亡(apoptosis)，細胞凋亡除了發生在清除老化、突變等異常的細胞外，在發育的過程中也扮演重要的腳色，比如說為了讓手掌的五根手指分開，就必須讓某些細胞凋亡，避免手指黏在一起，這是體內再正常不過的生理機制。
至於細胞凋亡是如何啟動的呢？細胞凋亡可分為內途徑(intrinsic pathway)以及外途徑(extrinsic pathway)
內途徑部分，當細胞受到壓力，如自由基、UV照射、來自其他細胞的訊息分子刺激(如接收到促使死亡的訊息、失去環境中促使細胞分裂、生長的訊息)，或是受到內在DNA複製出錯、細胞毒性蛋白質的堆積等，都有可能啟動細胞凋亡的機制，這個過程是被精密調控的，也有各種蛋白質參與其中，如抑制細胞凋亡的Bcl2蛋白，促進細胞死亡的Bax蛋白，平常Bcl2與Bax在細胞內會達到平衡，當平衡被破壞時，如促使細胞生長的激素EGF下降，Bcl2會減少；或受到UV照射，Bax轉錄以及表現的量增加時，細胞凋亡即會被啟動(Wu et al., 2008)。
Bax的活化，會使粒線體穿孔，使粒線體釋放出鈣離子與cytochrom c，cytochrom c會與APAF-1、pro-caspase 9蛋白形成凋亡小體，這時候粒線體的膜電位會下降。凋亡小體會催化出有活性的caspase 9，接著使下游的caspase 3、caspase 7活化，同時也讓磷脂絲胺酸(Phosphatidylserine, PS)由細胞膜內側翻轉到細胞膜外側。在凋亡的晚期，caspase 3與caspase 7會去切DNA等核酸，使DNA片斷化，同時caspase 3也會截切PARP-1，使其無法修復損傷的DNA，除此之外，此時的細胞膜通透性也跟著上升。
至於在外途徑部分，當細胞接收到特定外來訊號，如TNF-a、FasL (CD178,CD95L)、TRAIL這些訊號會與細胞上特定的接受器配對，如TNF-a的receptor為TNFR1/TNFR2 (CD120a/CD120b)；FasL的receptor為Fas (CD95, Apo-1)與DCR3；TRAIL的receptor有DR4、DR5、DCR1、DCR2等。外途徑並非如內途徑影響粒線體，而是透過活化caspase 8，caspase 8會作用於tBid蛋白，並活化下游的caspase 3與caspase 7，至此與內途徑相連。
然而在某些變異的細胞當中，他發展出能夠逃脫細胞凋亡的機制，如P53的突變。P53主要參與細胞中DNA的檢查、除錯，當DNA損壞時，P53會啟動一連串的修復機制，當DNA損壞程度至不可挽回時，P53則促使該細胞走向死亡，當P53失去功能，將使該細胞獲得逃脫細胞凋亡的能力，最後發展成生長失控、又有不死能力的癌細胞。因此，針對癌細胞逃脫凋亡的機制，科學家也不斷尋療法、藥物，希望能針對癌細胞重啟其凋亡的機制，同時讓藥物對一般細胞造成的傷害降到最小。
利用流式細胞儀來探究細胞凋亡有許多方法，根據細胞凋亡的各階段，有不同的指標能夠進行偵測，細胞凋亡主要分為早期凋亡、中期凋亡以及晚期凋亡。
Fig.1 .各階段細胞凋亡示意圖https://www.bio-rad-antibodies.com/apoptosis-overview.html。
在細胞凋亡的早期，磷脂絲胺酸(Phosphatidylserine, PS)會由細胞膜內側翻轉到細胞膜外側，這些外翻的PS可以與Annexin V蛋白結合，在Annexin V蛋白接上螢光訊號，透過流式細胞儀即可偵測經歷過早期凋亡的細胞群，配合核酸染劑PI的染色，則也可以標記出晚期凋亡的細胞，原因是因為PI無法通過細胞膜，因此活細胞不會被PI染上，只有在細胞膜的通透性增強(凋亡晚期)時，PI才會進到死細胞內。
Fig. 2.以Annexin V-FITC/PI偵測不同處理時細胞凋亡的比例，IL-1b誘導發炎以及細胞凋亡，ABS則具有保護作用，降低細胞凋亡之比例(Xu et al., 2017)。
雖然說PS外翻為細胞早期凋亡的其中一個指標，然而此過程是可以被回復的，當細胞遭受到壓力時，細胞除了選擇走向死亡以外，亦能夠去抵抗逆境，若細胞能順利度過壓力期，則回到原來的狀態，若無法抵抗逆境，則進入細胞凋亡。而粒線體膜電位(MMP)的喪失通常被認為是細胞凋亡中不可逆的一個步驟(後來有些研究指出，在某些細胞群內，細胞凋亡過此階段仍可回復(Tang et al., 2012))，那麼，該如何以流式細胞儀偵測粒線體膜電位的喪失呢？常用的染劑如DioC6、以及JC-1。
Fig.3 .染劑DioC6的光譜特性，虛線為激發光譜，實線為發射光譜。
Fig.4 . CCY-1a-E2誘導HL-60 粒線體膜電位下降的情形(Lin et al., 2016)。
Fig.5 .染劑JC-1的光譜特性，虛線為激發光譜，實線為發射光譜。
Fig.6 .染劑JC-1與粒腺體之關係圖(Sivandzade et al., 2019)。
JC-1為帶正電之染劑分子，進到細胞內後會受粒腺體之負電吸引，於粒腺體膜上形成二聚體之結構(dimer)，螢光在488 nm雷射激發下為橘紅色(em：585～590 nm)。當細胞凋亡的過程中，粒腺體的膜電位下降，JC-1不再受到粒腺體吸附，從而形成單體結構(monomer)，此時JC-1的螢光特性則會呈現綠色(em：510～527 nm)。
Fig.7 .處理DMSO (MOCK)、Valinomycin、以及混合處理之細胞，以流式細胞儀分析之圖形(Perelman et al., 2012)。可以注意到Fig.7右下角混合的組別，健康的細胞群位於585 nm的通道。
除了檢測MMP以外，流式細胞儀也能夠透過檢測活化的caspase 3、caspase 8、caspase 9來判斷是否有經歷細胞凋亡。
Fig.8 .處理NaN3的細胞其caspase 3、Zombie NIR的圖形。細胞凋亡時，活化的caspase 3訊號增強，而Zombie NIR為無法通透細胞膜的染劑，細胞死亡時訊號也會增強(Vossenkamper & Warnes, 2019)。
前面有提到晚期的細胞凋亡，細胞膜通透性會變強，DNA會被片斷化，以Annexin V/ PI進行染色的好處是可以比較好區分出凋亡各期的比例，然而也有比較簡單的作法，僅對片斷化的DNA進行染色，而常用的染劑包含前面提到的PI外，也包含7-AAD、DAPI、Hoechst33342等。
Fig.9. 以不同濃度Rheum undulatum萃取物MERL處理胃癌細胞株AGS，並以PI進行染色探討sub G1比例的變化(Hong et al., 2015)。
從Fig. 9的圖形可以觀察到，隨著MERL的處理，sub G1的比例有上升的趨勢，因DNA的片段化，訊號會弱於2N的peak。
介紹完原理部分，接著在執行實驗時容易遇到哪些問題呢？
1.執行Annexin V/PI染色時，常會有遇到訊號不明顯的情況，但這是因為細胞沒有死亡所以無訊號，還是實驗步驟中出了問題呢？我們一步步進行排除。
(1)執行實驗時，務必設計一組確定會讓細胞死亡的positive control，如以H2O2、漂白水處理之細胞，若該組別也無訊號則為染色問題；若positive control有訊號則應調整操作條件，有可能藥物處理的劑量不夠。
Fig.10 . H9c2細胞處理450 uM濃度的過氧化氫(H2O2)一個小時。
(2)執行實驗時也應設計單染的組別，有時候看不見訊號時，不一定是實驗失敗，須排除儀器設定時參數跑掉的情形，單染Annexin V以及單染PI可以幫助排除儀器設定的問題。執行單染實驗時，應選擇positive conrol處理的細胞進行，因經過細胞凋亡死亡的細胞才會被Annexin V以及PI染上，若取健康的細胞進行單染，可能都會呈現無訊號的狀態。設定好單染，確定每個訊號陽性的位置後，計算其螢光補償，有時候訊號位置異常，是因為螢光未補償或過度所造成。
(3)另外一個容易被忽略的地方為，當細胞凋亡時，細胞型態會改變，此時FSC/SSC所呈現的pattern也會移動，有可能在gating主要細胞群時會造成偏移。
Fig.11 . 不同的圈選策略下，細胞凋亡的比例變化圖。https://www.bio-rad-antibodies.com/apoptosis-flowcytometry.html
從Fig. 11中可見，在FSC、SSC當中，若細胞發生凋亡，型態會變小，顆粒性會變得比較複雜，會往圖形的左上方移動，若今天只有圈門B的位置，可能死亡的情形便會不明顯，可以將A、B兩個門一起圈，或是如圖中般分開討論。
2. 另外一個常見的情況為，未處理任何藥物的normal control cell即有嚴重的凋亡，若遇到此情形，分兩個步驟去排除：
(1)確認FSC/SSC圈選的位置，若今天閾值(Thresh hold)的設定過低，有可能會圈選到許多的碎片，這時應根據所使用的機型、細胞的大小去重新設定，使主群細胞佔擷取的細胞90%以上。
(2)上機前務必先鏡檢，確認normal control有無不健康之型態，或已經開始凋亡，除此之外，操作的流程也盡可能縮短，如Annexin V/PI、MMP、ROS具有時效性的實驗，操作時間過長可能就會死亡嚴重。
若有任何問題，可以隨時與我們討論！
Reference
https://www.bio-rad-antibodies.com/apoptosis-flowcytometry.html
Hong, N. R., Park, H. S., Ahn, T. S., Jung, M. H., & Kim, B. J. (2015). Association of a methanol extract of Rheum undulatum L. mediated cell death in AGS cells with an intrinsic apoptotic pathway. Journal of pharmacopuncture, 18(2), 26.
Lin, C. F., Yang, J. S., Lin, C., Tsai, F. J., Lu, C. C., & Lee, M. R. (2016). CCY-1a-E2 induces G2/M phase arrest and apoptotic cell death in HL-60 leukemia cells through cyclin-dependent kinase 1 signaling and the mitochondria-dependent caspase pathway. Oncology reports, 36(3), 1633-1639.
Perelman, A., Wachtel, C., Cohen, M., Haupt, S., Shapiro, H., & Tzur, A. (2012). JC-1: alternative excitation wavelengths facilitate mitochondrial membrane potential cytometry. Cell death & disease, 3(11), e430-e430.
Sivandzade, F., Bhalerao, A., & Cucullo, L. (2019). Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio-protocol, 9(1).
Tang, H. L., Tang, H. M., Mak, K. H., Hu, S., Wang, S. S., Wong, K. M., Wong, C. S. T., Wu, H. Y., Law, H. T., & Liu, K. (2012). Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular biology of the cell, 23(12), 2240-2252.
Vossenkamper, A., & Warnes, G. (2019). Flow cytometry reveals the nature of oncotic cells. International journal of molecular sciences, 20(18), 4379.
Wu, Y., Xing, D., Liu, L., & Gao, B. (2008). Regulation of Bax activation and apoptotic response to UV irradiation by p53 transcription-dependent and-independent pathways. Cancer letters, 271(2), 231-239.
Xu, X.-X., Zhang, X.-H., Diao, Y., & Huang, Y.-X. (2017). Achyranthes bidentate saponins protect rat articular chondrocytes against interleukin-1β-induced inflammation and apoptosis in vitro. The Kaohsiung journal of medical sciences, 33(2), 62-68.
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